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發布時間:2023-10-22 點此:348次
在已知化合物中約80%的化合物是親水性強、揮發性低的有機物,熱不穩定化合物及生物大分子,這些化合物的分析蕞適合于液相色譜,當然毛細管電泳也可以,只不過毛細管電泳的毛細管中無填料,因此“變數”較少,適應的復雜體系也較少,遠不及液相色譜使用得廣泛。當和質譜聯用時,液相色譜的流動相適合于流入質譜,LC-MS成為該類化合物質譜聯用分析的主流;毛細管電泳的流動相中常加入緩沖鹽,對于質譜不太友好,此外還需考慮毛細管出口端維持電泳的電流通路同時又可以進行電噴霧,由于“變數”少,接口較困難,因此CE-MS一直沒有LC-MS應用得廣泛。
液相色譜的構造分為5大部分:進樣部分(手動進樣或自動進樣),驅動液體流動的色譜泵,主導分離的色譜柱(有些配柱溫箱),檢測器、數據采集和分析系統。當同質譜聯用時,質譜成為液相色譜的檢測器,而為了同步數據采集及分析,色譜廠商通常開放接口,讓質譜廠商的軟件來控制液相色譜的進樣和分離,數據分析也交給質譜廠商。
液相色譜結構圖
在LC-MS聯用時,通常在色譜柱前端加裝短的保護柱來延長色譜柱壽命。若固定相使用未經修飾的氧化硅顆?;蛐揎椘渌邩O性物質,如氨基或氰基,則成為正相色譜,適合分析極性較強的分析物,洗脫時可通過調配極性差異大的兩種流動相溶液(如水和乙腈)比例,而得到適當極性的單一流動相溶液進行等度洗脫。在復雜樣品中,若要獲得更好的分離度,可以使用極性差異大的兩種流動相溶液(如水和乙腈)進行梯度洗脫。若固定相為經過C18、C8或苯基柱,則稱為反相色譜,適合分析低極性的化合物,亦可以進行等度或梯度洗脫。
在分析級液相色譜-質譜聯用中,大都使用內徑2.1mm或1mm的色譜柱,其流動相流速分別為約200~300 μL/min和50~75μL/min,有些情況下可使用4.6mm的色譜柱,其流動相流速為1mL/min,這時一般會在進入質譜前進行分流,讓少部分進入質譜,而大部分分流后可進行回收。
超高效液相色譜分離時,固定相顆粒從5μm降至3μm與1.7μm以下,這時分離效率更高,但同時需要超高壓液相泵(>400 bar或>6000psi),這時分離時間縮短到數分鐘內且不損失分離效能。在超高效液相色譜-質譜聯用時,其色譜峰底寬約在數秒內,因此在質譜方法設定上,需適當調整掃描速度以獲得足夠質譜圖數,從而完整描繪色譜峰。
納升級流速LC-MS常用于蛋白質組學等復雜微量樣品的分析。降低柱內徑可以得到較低的死體積,同時柱效大幅提高。例如,若原本用2.1mm的色譜柱分析樣品,當轉換至使用內徑75μm毛細管柱且注入相同樣品濃度時,理論上樣品峰濃度將會增加至約784倍。因此使用毛細管色譜柱對于電噴霧質譜儀(濃度靈敏檢測器)的信號提升將非常顯著。此時,達到較佳理論塔板數的Zui佳流速約為255 nL/min,理想進樣體積約24nL,這時需要更細微的注射器,不易實現。目前普遍的做法是,利用柱前端在線預濃縮方式,將微升級的樣品體積濃縮在色譜柱的zui前端以縮小樣品體積。另一方面,由于樣品承載量減少,超載的樣品量容易造成柱分離效率降低。為解決此問題,可在色譜分離柱的前端加入一個捕集柱(Trap Column),捕集柱的功能包含了樣品預濃縮與去除過多的樣品量。為匹配納升級流速,一般需要納升電噴霧接口。商品化的納升級流速LC-MS構建上,常使用一個六通閥連接捕集柱與分離柱,在捕集柱進行預濃縮時同時去除大部分樣品中的鹽類,濃縮后洗脫樣品到分離柱進行樣品分離。